quarta-feira, 31 de março de 2021

Como Fabricar Algo de la Nada

La PCR, los ciclos umbrales y los falsos positivos

 

Niels Harrit PhD

Mar 27, 2021 

 


 

RESUMEN: Si la inoculación puede usarse como verificación de la prueba de RT-PCR de Corman-Drosten para Covid-19, aproximadamente el 50% de los positivos anunciados deben considerarse falsos cuando se aplica un máximo de 35 ciclos. Si se aplican solamente 25 ciclos, la fracción de falsos positivos se reduce al 20%.

 

 La eficacia de la prueba de RT-PCR utilizada para identificar la infección por el virus SARS-CoV-2 y los "casos" de la enfermedad Covid-19 ha sido ampliamente discutida. En estas discusiones, a menudo se sostiene que la prueba produce un 97% de falsos positivos. Para respaldar esa afirmación se hace referencia a un estudio de un grupo con sede en Marsella que comunicó sus resultados en una carta al editor el 28 de septiembre de 2020. [1] 

 

  El primer autor es R. Jaafar, por lo que en adelante se denominará el documento de Jaafar. Se trata de un más amplio conjunto de datos en comparación con un estudio anterior [2] encabezado por B. La Scola. Esta publicación es conocido como el documento La Scola.

 En resumen, los resultados presentados en el documento de Jaafar no proporcionan una prueba independiente de que el test produzca un 97% de falsos positivos. En el presente comentario, intento destilar las conclusiones esenciales de sus datos.

 En el dominio semipúblico, ha sido otro motivo de confusión que la abreviatura "RT-PCR" a veces se denomina "Reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa", mientras que en otros casos se puede ver explicada como "PCR en tiempo real". .

Son ambas. Es la RT-PCR en tiempo real.

 La enzima transcriptasa inversa se ocupa de los fragmentos de ARN monocatenario en el hisopo y los convierte en ADN bicatenario en una serie de pasos. A partir de entonces, la enzima polimerasa comienza a hacer copias del ADN seleccionado. La selección está determinada por un par de los denominados cebadores [ primers ] que son necesarios para iniciar el proceso.

La replicación ocurre en ciclos. Cada ciclo comienza calentando la muestra para separar la doble hélice de ADN en dos hebras de ADN libres. Estos sirven como plantillas para que la polimerasa produzca hebras complementarias de cada uno de los componentes básicos presentes en la sopa. Al enfriarse, las hebras se recombinan. El ciclo termina y el resultado es una duplicación del número de moléculas de ADN anteriormente presentes.

Durante la producción, el ADN es marcado por una molécula de sondeo que emite fluorescencia solo cuando se incorpora al ADN. Por lo tanto, la muestra emite luz visible cuando se irradia con un pequeño láser. Se registra la intensidad de la fluorescencia en cada ciclo de la PCR como una medida de la cantidad de ADN que se produce. Ahí es donde entra el tiempo real. Cuando se alcanza un nivel predeterminado, el proceso de multiplicación se detiene y la prueba se denomina "positiva".

Se denomina el número de ciclos necesarios para alcanzar el nivel crítico de fluorescencia  el umbral de ciclo [ cycle threshold ] o Ct, que es una característica de cada muestra. Obviamente, si el proceso comienza con una gran cantidad de fragmentos de ARN, el umbral de intensidad de fluorescencia se alcanza facilmente y el Ct es bajo. Si la carga inicial son solo unas pocas moléculas de ARN, o tal vez incluso una sola pieza, pueden faltar muchos ciclos para obtener la señal de fluorescencia crítica.

 Esto significa que el valor Ct tiene el potencial de proporcionar una medida cuantitativa de la carga viral de cualquier persona. De algo puede servir si buscas una medida cuantitativa para tu condición temporal.

Una conversación en consecuencia puede ser así:

 "¿Cómo estás?"

 “Me fui al centro de pruebas. Me dijeron que me encuentro bien. Hoy tengo un Ct de 42".

 Como se entenderá a partir de lo siguiente, este intercambio puede indicar que la segunda persona sufrió un resfriado el otoño pasado, y que ya no presenta síntomas clínicos. Pero todas las muestras darían positivas si aplicáramos 60 ciclos porque “la PCR hace algo de la nada”, como una vez dijo Kary Mullis, el inventor de la tecnología PCR, y ganador del Premio Nobel.

 Si solamente falta un elevado número de cíclos para que la prueba dé positiva, todos debemos tener fragmentos de ADN y / o ARN, ya sean extraños o domésticos, en nuestro cuerpo, que son el objetivo de los cebadores que actualmente usamos. Con altos valores de Ct, se termina amplificando "el ruido molecular de fondo" de los fragmentos genéticos benignos. 

 

¡Todos tenemos un Ct todo el tiempo! 

 

 El artículo de Jaafar es una contribución a la importante discusión sobre la utilidad terapéutica de la metodología de la PCR. Más específicamente: "¿Cuál es el punto de inflexión para el Ct por debajo del cual una PCR proporciona una prueba significativa para el Covid-19 y por encima del cual no tiene sentido"? Desde el comienzo del brote de Covid-19 hasta la investigación que se concluye en dicha publicación, el instituto de Marsella realizó 250.566 pruebas de SARS-CoV-2 en 179.151 pacientes.

 

 De estas, 13,161 dieron positivas dentro de los 35 ciclos de la RT-PCR. Es decir, un 7.3%. 

 

De estas muestras positivas, 3790 fueron inoculadas y manejadas para cultivo. El proceso de inoculación se describe más o menos en el artículo de La Scola. [2]

 

Escriben que “se centrifugaron e inocularon 0,5 ml de líquido de hisopo en células VERA (línea celular de riñón de mono) y se observó el efecto citopatógeno”, en un número de días no revelado. 

 

Es decir, ¿las células murieron y se desintegraron? Esta observación debe haberse realizado bajo un microscopio óptico. Si se produce la muerte celular, los investigadores sacan una muestra líquida del vial y la procesan en consecuencia para su observación en un microscopio electrónico de barrido.

 

Los autores denominan a esto "Detección presunta de virus en el sobrenadante que muestra un efecto citopatogénico".

 

 En traducción, esto significa: "Si vemos que las células de los monos mueren y se desintegran en el microscopio óptico, llevamos la muestra al microscopio electrónico y creemos que todo lo que vemos allí debe ser el virus". 

 

 Sin embargo, no se proporcionaron imágenes de microscopio electrónico. 

 

La presencia de virus se "confirma" además con RT-PCR en dicho líquido. Un punto muy importante es que no se proporcionan los valores de Ct para estas RT-PCR ejecutadas en las muestras sometidas a microscopía electrónica. Si el ADN / ARN seleccionado por los cebadores antes y después de la inoculación se dirigió al mismo virus, los últimos Ct deberían ser sustancialmente más bajos que los Ct obtenidos de los hisopos iniciales. 

 

Si no fue así, realmente no sabemos por qué murieron las células. 

 

Pero supongamos por ahora que la muerte celular es un criterio para una inoculación exitosa y que las muertes son causadas por el mismo virus que se cuantifica en la prueba de RT-PCR. Así, Jaafar et al. informan que la inoculación fue exitosa en 1941 casos de los 3790 positivos por PCR que se manejaron para cultivo. Esto nos lleva a la evaluación inmediata de que el 49% de las pruebas de PCR positivas pueden haber sido falsas en el sentido de que la carga viral del paciente debe haber sido insignificante. 

 

 Que el 51% de las muestras exitosamente inoculadas represente un diagnóstico positivo de la enfermedad llamada Covid-19 depende de que el SARS-CoV-2 sea una entidad única, depende de un aislamiento demonstrado de la misma, y también depende de claras pruebas de que es el patógeno de la enfermedad. 

 

 En esta evaluación, por lo tanto, reservamos el término "positivo" a una muestra que alcanza el umbral crítico de fluorescencia. Los "positivos" comprenden las muestras inoculables y no inoculables (que son falsos positivos). 

 

 Los datos del artículo de Jaafar se reproducen en la Figura 1. Muestra la distribución entre las muestras inoculables y no inoculables para cada grupo de Ct, que van desde 11 (Ct11) a 37 (Ct37) ciclos. 

 

Es cierto que los inoculables comprenden solo el 3% del grupo Ct35. Pero como que solo hacía falta llevar 74 muestras hasta ese punto, no significa que la prueba de RT-PCR produzca un 97% de falsos positivos en general. El cuadro es más diverso.

 

 Figura 1. De Jaafar et al. Muestra muestras inoculables (marrón) junto con no inoculables (gris) para cada Ct. 

 

 Los mismos datos se muestran de una manera más tradicional en la Figura 2. 

 

Figura 2. Los mismos datos que la Figura 1, mostrados de forma tradicional. La línea negra representa cuántas muestras se someten a cultivo celular en cada grupo Ct. 

 

Buscamos una respuesta a la pregunta: ¿Cuántos ciclos deberían ser estándar si queremos que el 80% de los positivos representen una muestra inoculable? 

 

 Figura 3. Izquierda: Integración de las curvas de #inculables y # no inculables en la Figura 2. Es decir, suma de inoculables y no inoculables, respectivamente, registrados hasta un Ct dado. Derecha: Igual, como porcentaje de la suma de muestras cultivadas en Ct. 

 

 En la figura 3 (izquierda), el número de inoculables y no inoculables, respectivamente, se suma al valor Ct. Es decir, las curvas de la figura 2 están integradas. En la Figura 3 (derecha) se muestran los mismos datos como porcentaje del número total de muestras cultivadas hasta ese Ct. 

 

Se ve que en Ct25, el 80% de las muestras calificadas como "positivas" por la prueba de RT-PCR serán inoculables. Sin embargo, el 20% de los "positivos" serán falsos, si la inoculación es un punto de referencia para la eficacia de la RT-PCR. Algunos pueden encontrar eso como una compensación justa. 

 

Entonces, si: 1) existe tal cosa como el único virus SARS-CoV-2; y si 2) este virus causa síntomas respiratorios graves, y si 3) el virus es inoculable en las células VERA, y si 4) las células VERA son una representación válida de ídem humano, y si 5) la prueba de Corman-Drosten realmente detecta SARS-CoV-2 específicamente, realizar una RT-PCR complementaria hasta Ct 25 PUEDE tener alguna utilidad para un médico en un entorno clínico que trata a pacientes con síntomas respiratorios graves [3]. 

 

Un tanto fantástico, ¿no es cierto? 

 

 A fin de cuentas, todo gira en torno a los cebadores, su especificidad y aplicabilidad a bajas concentraciones. ¿Cómo pueden identificar a un virus mortal del SARS-CoV-2 cuando la existencia del mismo sigue sin demonstrar? Además, las secuencias de los diversos cebadores que se utilizan se encuentran en aproximadamente 100 bacterias y también abundan en el genoma humano. [4] [5] 

 

El emparejamiento de dos cadenas de ADN, la hibridación, no tiene por qué ser perfecto para que se produzca. Si las dos hebras son, digamos, solo un 80% complementarias, la constante de unión se reducirá. Pero la hibridación ocurre no obstante. Cuando se utiliza una concentración muy exagerada de cebadores en la prueba estándar de Corman-Drosten [6], inevitablemente recogerá a más ADN flotante, ya que fuera producido por la transcriptasa inversa o no. [7] 

 

UNA PRUEBA DE RT-PCR EN Ct25

 

 ¿Qué resultado se puede esperar SI la prueba de Corman-Drosten detectó algo llamado SARS-CoV-2 y se operó a un máximo de 25 ciclos? 

 


 

Figura 4. Izquierda: Suma de RT-PCR positivos manejados para cultivo hasta el grupo Ct (integración de la línea negra en la figura 2). Derecha: Los mismos datos se muestran como% de la suma total de positivos administrados para cultivo (3790). 

 

Consideren cómo el número total de muestras cultivadas en la Figura 4 (izquierda) aumenta parcialmente de forma lineal con el número de ciclos. Esto está de acuerdo con la noción de que el número de cultivos por grupo Ct alcanza una meseta más allá de Ct ~ 20 (figura 2), pero solo es digno de mención si la selección de muestras sometidas a cultivo ha sido aleatoria. 

 

 De este subgrupo (3790) sometidos a cultivo, seleccionados entre los denominados positivos por la prueba de RT-PCR en 35 ciclos, solo 1813 se habrían registrado como positivos si se hubieran aplicado solo 25 ciclos (Figura 4, izquierda), lo cual corresponde a 48% del subgrupo (Figura 4, derecha). 

 

 Dado que el 7,3% dio positivo por RT-PCR en 35 ciclos, se calcula que 7,3 x 0,48 = 3,5% darían positivos si el número de ciclos se limitara a 25.

 

 De estos, el 2.8% pueden ser confiables (80% según la inoculación) mientras que el 0.7% pueden ser falsos positivos - ¡Solo si la inoculación es un medio válido de confirmación y se cumplen todas las demás condiciones! 

 

COMENTARIO FINAL

 

Estar enfermo es tener síntomas. Si no estás enfermo, no estás contagioso. Solía ​​ser de sentido común que uno está sano a menos que no lo esté. El sentido común ya no es común durante la supuesta pandemia de Covid-19. Ahora estás enfermo hasta que se demuestre que estás sano y, por defecto, estás contagioso. La herramienta de esta estafa es la prueba de RT-PCR ejecutada en> 35 ciclos y más.

 

Dejémonos de tests y sobrevivamos.

 

                                                           ***

 

Referencias:



[1] Correlation Between 3790 Quantitative Polymerase Chain Reaction–Positives Samples and Positive Cell Cultures, Including 1941 Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus 2 Isolates.

[2] Viral RNA load as determined by cell culture as a management tool for discharge of SARS-CoV-2 patients from infectious disease wards.

[3] WHO Information notice for IVD users.

[4] The scam has been confirmed: PCR does not detect SARS-CoV-2, philosophers-stone.info.

[5] Conversations with Tom Cowan, at 18.13.

[6] Detection of 2019 novel coronavirus (2019-nCoV) by real-time RT-PCR

[7] Review report Corman-Drosten et al. Eurosurveillance 2020



Niels Harrit es profesor asociado de química (jubilado) en la Universidad de Copenhague. Fue el autor principal del revolucionario documento Active Thermitic Material Discovered in Dust from the 9/11 World Trade Center Catastrophe 

 

Traducción: David Montoute

Original en ingléshttps://off-guardian.org/2021/03/27/making-something-out-of-nothing-pcr-tests-ct-values-and-false-positives/

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